Τι είναι η κυτταρομετρία ροής

Η κυτταρομετρία ροής είναι μία αυτοματοποιημένη και ιδιαίτερα ευαίσθητη τεχνική που επιτρέπει τη μελέτη μεγάλου αριθμού κυττάρων σε μικρό χρονικό διάστημα και τη διάκρισή τους σε φυσιολογικά και παθολογικά.

Η ταυτοποίηση των κυττάρων γίνεται με βάση την παρουσία ή απουσία, καθώς και την ένταση της έκφρασης χαρακτηριστικών μορίων είτε στην κυτταρική τους μεμβράνη είτε στο εσωτερικό τους. Αντισώματα συνδεδεμένα με φθορίζουσες ουσίες αναγνωρίζουν και προσδένονται στα επιφανειακά ή στα ενδοκυτταρικά μόρια και αναλύονται στο κυτταρόμετρο με τη βοήθεια φωτεινών πηγών (Lasers). Τα σήματα φθορισμού που εκπέμπει το κάθε κύτταρο μετατρέπονται σε ηλεκτρικά σήματα και μεταφράζονται σε παραμέτρους που αναλύονται με ειδικό λογισμικό. Με αυτό τον τρόπο, μπορούμε να διακρίνουμε και να χαρακτηρίσουμε τους διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς που υπάρχουν σε δείγματα βιολογικών υγρών, όπως για παράδειγμα σε δείγματα μυελού των οστών, αίματος, κ.α.

Χρησιμοποιώντας αντισώματα συνδεδεμένα με διαφορετικές φθορίζουσες ουσίες μπορούμε να ανιχνεύουμε ταυτόχρονα σε κάθε μεμονωμένο κύτταρο του ίδιου κυτταρικού πληθυσμού από 2 έως και 12 διαφορετικά επιφανειακά ή ενδοκυτταρικά μόρια (πολυπαραμετρική/πολυχρωματική κυτταρομετρία ροής). Έτσι μπορούμε να προσδιορίσουμε αναλυτικά τον ανοσοφαινότυπο των κυττάρων ενός δείγματος.

Με την κυτταρομετρία ροής μπορούμε:

Ø      να αναλύσουμε τις φυσικοχημικές ιδιότητες των κυττάρων,

Ø      να διαπιστώσουμε την παρουσία συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών,

Ø      να αναλύσουμε κυτταρικές λειτουργίες και κυτταρικές αλληλεπιδράσεις, και

Ø      να ποσοτικοποιήσουμε τους μελετώμενους κυτταρικούς πληθυσμούς.

Τα πλεονεκτήματα της τεχνικής αυτής είναι:

Ø      η δυνατότητα ανάλυσης μεγάλου αριθμού κυττάρων (πχ. 10 εκατομμυρίων) σε μικρό χρόνο (πχ. 2-3 ώρες)

Ø      η ταυτόχρονη ανίχνευση έως και 12 χαρακτηριστικών μορίων στο κάθε κύτταρο του δείγματος

Ø      η ανίχνευση και ταυτοποίηση ελάχιστου αριθμού κυττάρων (πχ. 20 παθολογικά κύτταρα σε σύνολο 10 εκατομμυρίων κυττάρων του δείγματος).

Στην ογκολογία-αιματολογία, η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται κλινικά:

Ø      για τον προσδιορισμό του ανοσοφαινοτύπου των παθολογικών κυττάρων στις αιματολογικές κακοήθειες κατά τη διάγνωση, όπου παρέχει στοιχεία για τη σταδιοποίηση και την πρόγνωση της νόσου,

Ø      για την ανίχνευση και παρακολούθηση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου μετά τη θεραπεία,

Ø      για την αναγνώριση και ποσοτικοποίηση λεμφοκυτταρικών πληθυσμών, και

Ø      κατά τη μεταμόσχευση μυελού των οστών για την μέτρηση του αριθμού των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων.

Ανίχνευση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου με κυτταρομετρία ροής

Με τις σύγχρονες θεραπείες και τα βελτιωμένα θεραπευτικά σχήματα, οι ασθενείς με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση εμφανίζουν πολύ καλές ανταποκρίσεις, που στην πράξη μεταφράζονται στην πλήρη ή σχεδόν πλήρη εξάλειψη των κακοήθων πλασματοκυττάρων από το μυελό των οστών. Ωστόσο, μπορεί να παραμείνουν ελάχιστα κακοήθη πλασματοκύτταρα στο μυελό των οστών ακόμα και μετά από τη θεραπεία, που σε βάθος χρόνου ίσως αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται, οδηγώντας σε υποτροπή της νόσου. Το γεγονός αυτό καθιστά την ανίχνευση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (Minimal Residual Disease, MRD) μία πολύ σημαντική εξέταση με προγνωστική αξία για την πορεία των ασθενών, καθώς όσοι ασθενείς βρίσκονται θετικοί για MRD (δηλαδή έχουν ελάχιστη αλλά υπολειπόμενη νόσο) πιθανά θα υποτροπιάσουν γρηγορότερα σε σχέση με τους όσους έχουν αρνητική εξέταση για MRD (δηλαδή δεν έχουν υπολειπόμενη νόσο).

Επειδή μετά τη θεραπεία τα εναπομείναντα παθολογικά πλασματοκύτταρα είναι πρακτικά πολύ λίγα, για την ανίχνευσή τους απαιτείται η χρησιμοποίηση μιας τεχνικής με πολύ υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, που να μπορεί αφενός να ξεχωρίζει αποτελεσματικά τα κακοήθη από τα φυσιολογικά κύτταρα και αφετέρου να αναγνωρίζει και να ποσοτικοποιεί τους πολύ μικρούς αριθμούς των παθολογικών κυττάρων που ενδεχομένως έχουν παραμείνει στο μυελό των οστών. Η τεχνική που συνδυάζει τα παραπάνω χαρακτηριστικά και προτείνεται από τη Διεθνή Ομάδα Μελέτης του Μυελώματος (International Myeloma Working Group, IMWG) είναι η πολυπαραγοντική/πολυχρωματική κυτταρομετρία ροής επόμενης γενιάς.

Από τον Φεβρουάριο 2016, στη μονάδα κυτταρομετρίας ροής της Θεραπευτικής Κλινικής αναπτύξαμε και καθιερώσαμε πρότυπη εξέταση για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της MRD σε ασθενείς με πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες, κυρίως με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση. Η μονάδα που στεγάζεται στον Τομέα Φυσιολογίας Ζώων & Ανθρώπου του Τμήματος Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών διαθέτει κυτταρόμετρο κλινικού τύπου, εφοδιασμένο με 3 lasers για την διενέργεια πολυπαραμετρικών αναλύσεων 8 χρωμάτων. Το επίπεδο ευαισθησίας που επιτυγχάνεται για την ανίχνευση των παθολογικών πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών είναι της τάξης του 10^-6 (δηλαδή ανιχνεύουμε ένα παθολογικό κύτταρο ανά 1.000.000 κύτταρα που αναλύονται). Η μονάδα κυτταρομετρίας ροής της Κλινικής μας είναι πιστοποιημένη για την Παροχή Διαγνωστικών Υπηρεσιών (ex vivo) σύμφωνα με το Σύστημα Διαχείρισης ISO:9001, και πρόσφατα εντάχθηκε στα εργαστήρια αναφοράς για κυτταρομετρία ροής της Ευρωπαϊκής Κοινοπραξίας Euroflow.

Προσδιορισμός ανοσοφαινοτύπου με κυτταρομετρία ροής

Σε νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες κυρίως με πολλαπλούν μυέλωμα, ο αναλυτικός προσδιορισμός του ανοσοφαινοτύπου των παθολογικών πλασματοκυττάρων βοηθά:

Ø      στον προσδιορισμό του αρχικού ανοσοφαινοτυπικού προφίλ της νόσου που διευκολύνει τη μετέπειτα παρακολούθηση της πορείας του ασθενούς μετά από τη θεραπεία για την παρουσία ή όχι MRD,

Ø      στην επιλογή του καταλληλότερου θεραπευτικού πρωτοκόλλου με βάση τα χαρακτηριστικά των παθολογικών πλασματοκυττάρων,

Ø      στην πρόγνωση του νόσου, η οποία σχετίζεται αφενός με το ποσοστό των παθολογικών αλλά και των φυσιολογικών πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών και αφετέρου με την έκφραση συγκεκριμένων επιφανειακών μορίων στα παθολογικά πλασματοκύτταρα (πχ. CD19, CD56, CD117, CD81), και

Ø      στην παρακολούθηση της εξέλιξης και πιθανά μετασχηματισμού των ασυμπτωματικών μορφών της νόσου, MGUS και SMM, σε συμπτωματικό μυέλωμα.

Λήψη δείγματος μυελού των οστών για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

Η ανίχνευση της MRD γίνεται σε δείγμα μυελού των οστών (απλή αναρρόφηση – όχι βιοψία).

Το κάθε δείγμα επεξεργάζεται και αναλύεται εντός της ίδιας ημέρας, προκειμένου να αποτυπωθούν άμεσα τα χαρακτηριστικά των κυττάρων.

Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων και η αναλυτική καταγραφή του ανοσοφαινοτύπου είναι διαθέσιμα εντός 7-10 εργασίμων ημερών.

Η ανάλυση του ανοσοφαινοτύπου με κυτταρομετρία ροής είναι εγκεκριμένη από τον ΕΟΠΥΥ και δεν έχει κόστος για τον ασθενή.

Συνεργαζόμενοι ερευνητές της μονάδας κυτταρομετρίας ροής

Ουρανία Τσιτσιλώνη, Βιολόγος-Ιατρός, Καθηγήτρια Ανοσολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ (e-mail: rtsitsil@biol.uoa.gr)

Ιωάννης Κωστόπουλος, Βιολόγος, MSc, PhD, κύριος μεταδιδακτορικός ερευνητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

Νικόλαος Ωρολογάς, Βιολόγος, MSc, PhD, μεταδιδακτορικός ερευνητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

Παντελής Ρουσάκης, Βιολόγος, MSc, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

Χρυσάνθη Παντελή, Χημικός, MSc, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

Στοιχεία επικοινωνίας

Διεύθυνση: Τμήμα Βιολογίας (3^ος όροφος), Πανεπιστημιούπολη, Ιλίσια, 15784, Αθήνα

Τηλέφωνο: 210-727-4215, -4889, -4707

e-mail: rtsitsil[at]biol.uoa[dot]gr